date:2026-01-29 13:08:38
當今，建立具有生理學相關性的體外組織和器官模型仍然是科學家的一大挑戰。實現這一目標的重要一步，體現在眾多新興技術將3D培養平臺與微流控技術相結合。事實上，微流控方法能夠更好地重現生理條件，使細胞在“類體內 (in vivo-like)”環境中生長[1]。微流控的主要優勢在于持續供應營養物質，同時清除代謝產物，這種動態過程有助于減少所需培養基和補充劑的用量 [2]。
VITVO® 是一款易于操作的3D細胞培養生物反應器。該裝置由一個內部惰性合成基質構成，并封裝在一個由兩個透明氧合膜和一個帶有進樣口和出樣端口的周邊框架組成的結構中。VITVO基質允許多種細胞類型生長，包括共培養。其裝置結構使得流體能夠穿過其厚度，從而截留細胞。得益于VITVO的標準連接件，可以輕松建立一個實現3D動態培養的流體模型[3]。
市面上有多種泵系統。它們的不同特性使其適用于特定的實驗要求。ibidi流體剪切力系統通過對充滿培養基的儲液器施加氣壓來產生流動。通過特殊的切換模式循環培養基，可以產生恒定的單向流動。這使其成為長期細胞培養中施加定義剪切應力的理想設置。使用ibidi流體剪切力系統，可以模擬連續和脈動層流，以及振蕩流。
本文旨在評估VITVO生物反應器與ibidi流體剪切力系統（ibidi泵系統）之間的兼容性和協同作用，以開發一種精確定義的微流控應用，為3D動態細胞培養開啟新的可能性（圖1）。
圖1. 整合ibidi流體剪切力系統和VITVO生物反應器的示意圖
材料
• VITVO® 生物反應器 (Rigenerand srl)
• 2.5 mL注射器 (Becton Dickinson and Co)
• 人乳腺癌MDA-MB 231細胞系(DSMZ, ACC 732)
• DMEM/F-12培養基 (Gibco, 31330038)
• 人纖維肉瘤HT1080細胞系(DSMZ, ACC 315)
• 基礎培養基DMEM (Gibco, 41965039)
• FCS (Gibco, 10270106)
• 胰酶/EDTA (Gibco, 15400)
• Laminin (BioLamina, LN521-02)
• ibidi Pump System流體剪切力系統(ibidi GmbH, 10902)
• Perfusion Set Blue灌流管套裝(ibidi GmbH, 10961)
• NucBlue™ Live ReadyProbes™™ 試劑 (Hoechst 33342) (Life technologies, R37605)
方法
3D細胞培養建立：
一個VITVO基質用層粘連蛋白Laminin (60 µg/ml) 包被，并在37°C下孵育過夜。隨后，MDA-MB 231細胞以300,000細胞/mL的濃度重懸于培養基(DM EM/F-12 + 10% FCS)中，并使用注射器注入包被后的VITVO基質內。同時，另一個VITVO接種HT1080細胞：該基質首先用預熱的培養基（DMEM + 10% FCS）進行預處理，然后將300,000細胞/mL的HT1080細胞懸液注入裝置內部。兩種3D培養物都在37°C、5% CO2條件下孵育過夜，以使細胞貼附到纖維基質上，然后再連接到實驗回路。
VITVO與ibidi流體剪切力系統的動態回路設置：
灌流管套裝(Perfusion Set)采用無菌包裝。為排出硅膠管和塑料部件中的氣體，將灌流管套裝連同包裝一起放入培養箱中過夜。從包裝中取出灌流管套裝時，請將流體單元(Fluidic Unit)置于超凈工作臺內。將儲液器插入流體單元的支架中，并檢查適配器的密封性。在連接VITVO裝置前，先進行初始的除氣泡、夾管閥測試和流速校準。
連接VITVO到灌流管套裝時，用軟管夾夾住管路。取下端口1的封閉帽，將裝置垂直放置，開口端口朝上。在開口端口處形成彎月面，以避免連接到灌流管套裝的Luer接頭時截留氣泡。連接端口1后，翻轉VITVO，重復上述步驟連接端口2。移除軟管夾，并在連接好兩個端口后重新校準流速。每個VITVO按照上述描述連接到灌流管套裝，并放置在37°C、5% CO2的培養箱中培養7天（圖2A）。
結果與討論
MDA-MB 231和HT1080細胞在ibidi流體剪切力系統動態條件下成功于VITVO培養基中培養，灌流管路中施加的壓力維持在5至10毫巴（圖2A）。培養7天后，細胞經NucBlue Live ReadyProbes染色，并通過Nikon Eclipse Ti Orca Flash 4.0L顯微鏡搭配4倍物鏡對3D細胞培養進行可視化觀察。明場顯微鏡觀察VITVO基質時僅能顯示基質纖維（圖2B左側）； 細胞需經熒光標記或熒光染色方可顯現（圖2B右側）。NucBlue染色結果表明兩種細胞培養物在動態條件下均表現出良好增殖能力，這為根據實驗的多種需求，設置ibidi流體剪切力系統和VITVO的定制配置提供了可能性。
圖2. A)帶有MDA-MB 231細胞（左）和HT1080細胞（右）的VITVO流體回路。B)灌流培養7天后NucBlue染色。寬場熒光顯微鏡，4x物鏡
結論
VITVO生物反應器和ibidi流體剪切力系統可組合使用，建立適用于不同研究目的的多種3D動態培養體系。VITVO裝置的多功能性支持多種細胞類型的體外培養，由此衍生出多種應用可能性。將ibidi流體剪切力系統與小型VITVO生物反應器結合使用，可開發出多種動態3D細胞培養模型，以更逼真地模擬體內環境中的間質流，同時實現對流速和剪切應力的精確調控。
參考文獻
[1].Van Duinen V, Trietsch S J, Joore J, Vulto P and Hankemeier T. Microfluidic 3D cell culture: tools to tissue models. Current Opinion in Biotechnology. 2015, 35:118-126.
http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2015.05.002
[2].Chen C, Townsend A D, Hayter E A, Birk H M, Sell S A, Scott Martin R. Insert-based microfluidics for 3D cell culture with analytical and bioanalytical chemistry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. DOI: 10.1007/s00216-018-0985-y.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0985-y
[3]. Candini O, Grisendi G, Foppiani EM, et al. A Novel 3D In Vitro Platform for Pre-Clinical Investigations in Drug Testing, Gene Therapy, and Immuno-oncology. Sci Rep. 2019;9(1):7154. Published 2019 May 9. doi:10.1038/s41598-019-43613-9.
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