給血管內(nèi)皮細胞模擬體內(nèi)流體環(huán)境
細胞剪切力實驗--流體剪切力為多功能干細胞來源的內(nèi)皮細胞提供真實的模擬條件
美國的科研人員希望能夠通過誘導(dǎo)多功能干細胞來源的內(nèi)皮細胞（iPSC-EC）建立一個血管發(fā)育的模型。其中，對內(nèi)皮細胞的剪切力是，血管發(fā)育中不可或缺的條件。流體剪切力能夠使細胞排列緊密，有規(guī)律。這里以iPSC-EC細胞為例，使用ibidi Pump System 進行一個流動剪切力條件下的細胞培養(yǎng)與靜置狀態(tài)下的細胞培養(yǎng)的對比實驗。
一、實驗準(zhǔn)備實驗材料及設(shè)備
1）細胞： iPSC-EC （CDI, Madison,WI）
2）培養(yǎng)基：VascuLife VEGF Medium（Lifeline Cell Technologies, Frederick, MD）
3）培養(yǎng)耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.6 Luer （ibidi，Germany，80186）
灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）
封口夾
4）儀器設(shè)備：ibidi流體剪切力系統(tǒng)，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）
二、實驗方法
在實驗開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養(yǎng)基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中放置過夜，排除由于溫度差產(chǎn)生的微量氣泡。
一）按照下面流程鋪細胞：
1）將1×105 cells/cm2密度的細胞懸液加入通道載玻片中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細胞懸液充滿整個通道（圖一）。
2）蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)半小時，等待細胞貼壁。細胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個注液孔中分別加入60μl培養(yǎng)基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養(yǎng)基（圖二）
3）將通道載玻片再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)2-4小時左右，等到細胞剛剛長滿為單細胞層，即可開始實驗（圖三）。注意，要使用單層細胞進行剪切力實驗，使每個細胞均受到均勻的剪切力。
圖三
4）靜置條件下細胞培養(yǎng)。在通道載玻片中靜置培養(yǎng)的細胞可以作為流體剪切力條件下培養(yǎng)的細胞對照。待流體實驗開始的同時，將靜置細胞培養(yǎng)的對照組放入二氧化碳培養(yǎng)箱中進行72h的培養(yǎng)。注意，培養(yǎng)過程中每天都要更換培養(yǎng)基。
二）搭建流體系統(tǒng)
1）將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入12ml培養(yǎng)基。這時不需要連接通道載玻片。實驗前需要去除整個灌流管中的氣泡，存留在灌流系統(tǒng)的氣泡會影響剪切力的大小，有時還會使灌流系統(tǒng)中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統(tǒng)，在任務(wù)欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統(tǒng)將自動運行下面任務(wù)，用于去除氣泡。（表一）
2）連接通道載玻片。去除氣泡后，就可以將之前準(zhǔn)備好的含貼壁細胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統(tǒng)中取下，放到超凈臺中。將通道載玻片的注液孔用培養(yǎng)基裝至過滿狀態(tài)(
）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖四）。
圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產(chǎn)生氣泡，會有部分培養(yǎng)基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無塵紙將溢出的培養(yǎng)基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀測一下通道內(nèi)的細胞狀態(tài)。
3）檢查灌流系統(tǒng)是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲液管液面不會下降或者上升，那么，整個系統(tǒng)就是密封的，并且是正確安裝的（圖五）。
圖五
4）開始流體剪切力實驗（單向?qū)恿鳎?。將搭建好的流體單元與流體剪切力泵相連后，將整個流體單元放入二氧化碳培養(yǎng)箱中。打開控制軟件，設(shè)置20 dyn/cm2 培養(yǎng)72h。
三）免疫熒光實驗
1）去除通道內(nèi)培養(yǎng)基。用1mlPBS沖洗通道，在注入PBS的同時，用槍頭從另一個注液孔吸出廢液。
2）加入約200μl的4%多聚甲醛的PBS溶液，用槍頭從另一個注液孔吸出廢液。靜置10分鐘。
3）按照步驟1）沖洗通道
4）加入200μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘
5）按照步驟1）沖洗通道
6）加入200μl 1% BSA的PBS溶液封閉20分鐘
7）按照步驟1）沖洗通道
8）依次加入一抗，二抗進行免疫熒光染色后，沖洗通道并加入封片液進行顯微鏡觀察。
三 實驗結(jié)果
一）形態(tài)對比
在培養(yǎng)7天之后，可以直接用顯微鏡觀察到細胞的形態(tài)發(fā)生了顯著的變化，在剪切力刺激下培養(yǎng)的細胞形態(tài)更加修長，排列更加緊密和規(guī)律。而靜置狀態(tài)下培養(yǎng)了7天的細胞形態(tài)沒有顯著的變化（圖六）。
圖六：如上所示，在20 dyn/cm2刺激下的細胞更為修長排列更加緊密。細胞核；藍色；綠色：VE- cadherins。
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